Клиника Генезис Днепр IVF

Владимир Исаченко, Роберт Мэттнер, Карл Штерзик, Эрвин Штрелер, Рольф Крайнберг, Катарина Хэнке, Стеффен Рот, Евгения Исаченко

Кафедра гинекологической эндокринологии и репродуктивной медицины, Ульмский университет, Prittwitzstr. 43, 89075 Ulm, Germany; Центр репродуктивной медицины, Endokrinologikum Ulm, Praxisklinik Frauenstrasse, Frauenstr. 51, 89073 Ulm, Germany; Xceltis GmbH, Im Tal 12, 74909 Meckesheim, Germany

Владимир Исаченко получил степень кандидата наук в области физиологии человека и животных в г. Харьков, Украина. С 1985 года работает в сфере репродуктивной биологии. До начала работы с эмбрионом человека  в 1990 году, работал с ооцитами и эмбрионами сельскохозяйственных и лабораторных животных. Сегодня его деятельность на Кафедре гинекологической эндокринологии и репродуктивной медицины Ульмского университета, Германия, в основном, посвящена разработке новых методов сохранения генома раковых пациентов посредством витрификации сперматозоидов, ооцитов, фолликулов и овариальной ткани. Конкретный  научный интерес представляет собой вопрос воздействия холода на геном.

Аннотация

Культура человеческих эмбрионов in-vitro в условиях воздействия коротких интервалов механической стимуляции, что  способствует повышению показателей развития эмбриона. Эта методика представляет собой попытку воспроизвести естественные условия, при которых жидкость маточной трубы приводится в движение ресничками эпителия. Данное явление может быть объяснено тем фактом, что развитие эмбриона in vivo, как правило, сопровождается непрерывными вибрациями на частоте около 6 Hz с периодически повторяющимся возрастанием до 20 Hz. Настоящий обзор охватывает историю исследуемого вопроса и, в свете этого, предлагает биологическую  концепцию относительно последних разработок в данной области: in-vitro культ человеческих эмбрионов с механической микровибрацией. Был рассмотрен эффект механической микровибрации на развитие эмбриона в культуре in-vitro. Показатели беременности после пересадки эмбриона в группе с культивированием  in-vitro под воздействием механической вибрации повысились.

Культура in-vitro для ооцитов и эмбрионов: непрерывный процесс совершенствования

Ранние попытки культивировать эмбрионы грызунов на стадии дробления полностью в условиях культуры in-vitro не имели большого успеха (Defrise, 1933; Mark and Long, 1912; Tarkowski, 1962; Washburn, 1951; Warwick and Berry, 1949). Последующие попытки, предпринимаемые специалистами по всему миру с целью улучшения существующих культур in-vitro, в основном, были сосредоточены на изменении компонентов растворимых сред, например, солей, источников энергии или азота, и вскоре основным предметом подобных исследований стали факторы роста/гормональные добавки (Biggers and Summers, 2008; Loutradis et al., 2000; Summers et al., 2005).

Независимо от типа среды и объема культуры, все культуры можно описать как стандартную статическую систему, содержащую незначительный (несколько микролитров) или относительно значительный (до 1000 µl) объем культурной среды (Brison et al., 2004; Thompson, 2007; Gardner and Lane, 2000).

Однако подобные условия культивирования  значительно отличаются от естественных. Авторы одного из недавних обзоров (Fauci and Dillon, 2006) описали репродуктивный механизм как сложную организацию, требующую согласованности поведения подвижных сперматозоидов и мышечных сокращений матки и маточной трубы, а также биения ресничек эпителия во время транспортировки эмбриона по маточной трубе в матку. На протяжении этого срока (около 5–7 дней), реснички генерируют усилия, которые способствуют движению жидкости, а их конфигурация, в свою очередь, обусловлена динамикой жидкости (Fauci and Dillon, 2006). Все это формирует динамическую среду, в которой развивается эмбрион (Foo and Lim, 2008; Muglia and Motta, 2001). Динамику культур можно повысить за счет химических факторов (Hardy and Spanos, 2002; Muglia and Motta, 2001), что может привести к усилению положительного воздействия гормонов и питательных веществ на яйцеклетки или эмбрионы (Anand and Guha, 1978; Blake et al., 1983).

Хорошо известно, что микро- и макросреда играют важную роль в определении потенциала развития эмбриона, культивированного in vitro или выращенного in vivo. Исследования, направленные на совершенствование данной микросреды, проводились в соответствии с двумя основными стратегиями. Первая стратегия заключается в развитии статической культуры, в которой отдельные клетки или эмбрионы помещаются в гель (например, альгинат натрия) для их изоляции от возможного вредного воздействия окружающей макросреды (Torre et al., 2007), либо искусственная микросреда создается путем культивирования эмбриона в специальных микролунках на дне чашки (Hoelker et al., 2009; Vajta et al., 2000). Вторая стратегия предполагает развитие динамической культуры, в которой, как и ранее, в целях изоляции от вредного воздействия окружающей макросреды отдельные клетки помещаются в агаровый гель (Willadsen, 1979) и создается перфузионная система, в которой питательные вещества циркулируют только в пределах культивируемых тканей/клеток (Folkman et al., 1966; Rose, 1967).

Условия окружающей среды, создаваемые системами распространения, являются крайне благоприятными для содержания тканей куриного эмбриона на протяжении длительных периодов времени (Rose, 1967). Недавние исследования подтвердили ранее полученные результаты, указывающие на то, что культура эмбрионов in-vitro с использованием микрофлюидальных устройств (микроканалов, которые содержат субмикролитры питательных средств) приводит к процентному сокращению доли дегенеративных эмбрионов (Raty et al., 2004).

В то же время, данный тип статических микрофлюидальных культур не продемонстрировал благоприятного влияния на показатели беременности. Дальнейшее изучение вопроса использования динамической микрофлюидальной культуры с непрерывной перфузией сред в целях культуры эмбрионов выявило низкую эффективность данного подхода (Hickman et al., 2002), предположительно, в связи со сдвиговым напряжением (Walker et al., 2004) или устранением аутокринных стимуляторов роста (Paria and Dey, 1990). Согласно недавней публикации (Heo et al., 2010), новое микроканальное устройство, имитирующее движения тела, может преодолеть отрицательное воздействие микрофлюидальных культур (Paria and Dey, 1990; Walker et al., 2004). Эта новая культура приводит к незначительному росту числа клеток бластоцисты, количества бластоцист на данной стадии развития и  вылупившихся бластоцист, а также к повышению показателей имплантации и беременности (Heo et al., 2010). Несмотря на столь многообещающие результаты, сама процедура и микроканальное устройство для данной культуры являются весьма сложными и потребовали бы определенного упрощения в целях рутинного использования в программах ЭКО.

Культура in-vitro: искусственная статика или естественная динамика

Со времени рождения Луиз Браун, первого ребенка, зачатого путем ЭКО (Steptoe and Edwards, 1978) база знаний в области репродуктивной медицины значительно расширилась. После этого прорыва основной целью репродуктивной биологии стало получение высококачественных предимплантационных эмбрионов in-vitro. Существующие на сегодняшний день вспомогательные репродуктивные технологии предполагают использование статических культур. Однако в естественных условиях (in vivo) яйцеклетка, сперматозоид и эмбрион подвергаются влиянию непрерывно меняющихся динамических процессов. Например, при использовании популярного метода культивирования эмбрионов в небольших каплях существует вероятность накапливания токсичных веществ, таких как радикалы кислорода (Johnson and Nasresfahani, 1994) и аммиака (Gardner and Lane, 1993). Они оказывают доказанное негативное воздействие на эмбрион. Основным принципом такой культуры является обновление среды. И хотя периодическая смена сред может помочь предотвратить накопление токсинов, подобная манипуляция приводит к нарушению баланса с отменой полезных ауто- и паракринных факторов (Fukui et al., 1996). Развитие эмбриона в естественных условиях, по мере его продвижения по маточной трубе, сопровождается непрерывным выведением метаболитов, газообменом и воздействием ряда факторов, отсутствующих in vitro, которые способствуют взаимосвязи зародыша и материнского организма (Hill, 2001; Paria and Dey, 1990). Такая разница в условиях, тчасти, может быть причиной нарушений развития предимплантационных эмбрионов in-vitro (Harlow and Quinn, 1982).

В случае использования статической культуры, единственное, что может предотвратить разрушительное влияние метаболитов на эмбрион – это замена старой среды на новую. Предимплантационный эмбрион млекопитающего представляет собой относительно автономную систему. Посредством самоконтроля такая система может регулировать собственное деление клеток, не контактируя при этом с материнскими половыми путями (Schultz and Heyner, 1993). Таким образом, самоконтролируемая система in vitro производит диффундирующие эмбриотрофные паракринные/аутокринные факторы, например, фактор активации тромбоцитов, которые частично отвечают за регуляцию развития эмбриона на ранних этапах (Gopichandran and Leese, 2006). По данным настоящего исследования, расстояние между отдельными эмбрионами крупного рогатого скота в культуре влияет на предимплантационное развитие, особенно на формирование бластоцист, число клеток и метаболизм. На протяжении всего периода культивирования  in-vitro, зачастую – при обновлении среды, помимо нежелательных метаболитов эмбриона, исключаются также и эмбриотрофные паракринные/аутокринные факторы.

Естественная культура in-vivo: непрерывное движение

В природе все этапы оплодотворения (принятие созревших ооцитов, создание подходящей среды для оплодотворения) и развития эмбриона с последующей доставкой в матку происходят в фаллопиевой трубе. Этот многофункциональный орган проявляет механическую активность с динамикой двух типов: мышечной и клеточной. Движение яйцеклетки приобретает комплексный характер быстрых колебаний вперед и назад, связанных с сегментным сокращением стенки маточной трубы. Цель подобных мышечных (перистальтических) и сегментных мышечных сокращений может заключаться в приведении содержимого трубы в движение для обеспечения смешивания гамет и эмбрионов с трубным секретом (Muglia and Motta, 2001). Слизистая трубы имеет структуру продольных складок и состоит из одного слоя кубовидного, или столбчатого эпителия.

Основные типы клеток данного эпителия – секреторные и реснитчатые (Lyons et al., 2006), с вибрацией, или движением, ресничек в сторону матки (Chauveau et al., 1973). Рядом исследователей было продемонстрировано, что движение ресничек зависит от этапа менструального цикла. Таким образом, у человека отмечено значительное повышение частоты вибраций в перешейке и ампуле после овуляции (Critoph and Dennis, 1977). Более того, недавние исследования, основанные на методе контрастного усиления, говорят о повышении частоты биения ресничек до 5.8 ± 0.3 Hz в фимбриальной части трубы на протяжении секреторной фазы (Lyons et al., 2002), в сравнении с пролиферативной фазой (4.9 ± 0.2 Hz).

Вибрация ресничек эпителия маточной трубы

Под «ресничками» (лат. – cilia) понимаются вибрирующие волоски. Согласно исследованиям, базовая частота биения ресничек варьируется от человека к человеку в диапазоне 5–20 Hz (Paltieli et al., 1995; Westrom et al., 1977). На более высоких частотах механический контакт между ооцитом/эмбрионом на протяжении секреторной фазы также существенно увеличивается. Биение ресничек отличается следующими характеристиками:

1. частота таких колебаний удивительно единообразна (Borell et al., 1957);

2.биение конкретной реснички и соседних волосков может быть охарактеризовано как хорошо скоординированное, с формированием четкой метахрональной волны (Holwill, 1974). Подобный метахронизм определяется как координированное колебание с четкой фазовой синхронизацией микровибрации между ресничками одной клетки и четкой фазовой синхронизацией этой вибрации между ресничками соседних клеток. Жидкость, окружающая реснички и формирующая изолирующий слой над их кончиками, представляет собой взвесь слизи (Miller, 1968).

Таким образом, маточная труба может оказывать значительное влияние на развитие эмбриона ввиду следующих факторов:

1. сдвигового напряжения, связанного с движением трубной жидкости;
2. компрессии, связанной с перистальтическим движением трубной стенки;
3. плавучести;
4. силы кинетического трения между эмбрионом и ресничками (Xie et al., 2006).

В результате действия упомянутых факторов средняя скорость яйцеклетки составляет 0,1 µms^-1, причем во время сильного сокращения стенок, под воздействием которого размер полости уменьшается до менее чем 160 µm, т.е. почти до размера яйцеклетки, скорость может возрасти до 3,8–6,8 µms^-1 (Greenwald, 1961). Движение жидкости, вызванное перистальтикой стенок, схоже с движением, которое провоцируется биением ресничек, и имеет среднюю скорость 8,6 µms^-1 (Anand and Guha, 1978). Однако, по мере продвижения эмбриона по маточной трубе в направлении матки, фиксируются показатели так называемой «пунктирной» скорости. Согласно неопубликованным данным (H. Croxatto, личное общение, Xie et al., 2006), скорость эмбриона, ввиду подобной прерывистости движения жидкости, может варьироваться от 6,5 до 29,7 µms^-1. Тем не менее, такое краткосрочное снижение или повышение скорости не наносит вреда эмбриону in vivo (Xie et al., 2006, 2007).

Культура in-vitro с микровибрацией имитирует культуру in-vivo

Воссоздание условий in-vitro в маточной трубе – задача непростая. Например, движение жидкости и механическое стимулирование эмбриона во время культивирования может привести к повреждению градиентов концентрации субстратов, секреторных молекул, растворенных газов и продуктов жизнедеятельности. И хотя концентрации газов, субстратов или метаболитов с трудом поддаются измерению в культуре, можно предположить, что подобные нарушения градиентов могут возникнуть в результате текучести среды и стимулирования эмбриона (Heo et al., 2010). С другой стороны, движение может предотвратить накопление непотревоженных слоев вокруг эмбриона и содействовать обмену газов и/или метаболитов. Еще одной потенциальной проблемой является сдвиговое напряжение как функция скорости эмбриона и потока текучей среды, поэтому было предложено, что скорость эмбриона должна повторять скорость движения в трубе (Matsuura et al., 2010). По результатам недавних исследований, динамическая микрофлюидальная культура эмбриона с двигающейся средой привела к улучшению показателей развития мышиных зародышей (Heo et al., 2010).

Важность роли физической/механической среды в развитии эмбриона подчеркивает работа, проведенная группой профессора Смита[6] (Heo et al., 2010), в рамках которой было установлено, что использование динамической микрофлюидальной культуры in-vitro с пульсирующей текучестью среды в течение 48 часов, но не 96 часов, приводит к увеличению числа клеток бластоцист по сравнению с аналогичным показателем для статической культуры. Это говорит о том, что продолжительность пульсирования текучей среды имеет определенную важность, но не соотносится с конкретной стадией развития. Подобные выводы могут иметь далеко идущие последствия, поскольку они дают основания утверждать, что данная культура не угрожает биологии зиготы, которая интенсивно развивается в первые 48 часов (Ma et al., 2001; Schultz, 1993). Соответственно, культура с пульсирующей двигающейся  средой рассматривается как потенциально неопасная и не влияющая на последующие события в рамках предимплантационного развития, к которым относятся, в частности, уплотнение на 8-клеточной стадии и формирование бластоцист. При использовании данной культуры были получены следующие результаты:

1. доля вылупляющихся или вылупившихся бластоцист составила 31% для микрокапель, 23% для микроканалов и 71% для микроканальных пульсирующих систем (P < 0,01);
2. среднее число клеток на одну бластоцисту составило 67 ± 3 для микрокапель, 60 ± 3 для микроканалов и 109 ± 5 микроканальных пульсирующих систем, в сравнении с показателем на уровне 144 ± 9 для бластоцист, выращенных in-vivo.

Полученные таким образом результаты указывают на то, что благоприятное воздействие пульсирующей текучей среды в микрофлюидальной системе  с точки зрения потенциала развития эмбриона может быть объяснено близостью культурной микросреды условиям in-vivo (Heo et al., 2010). По мнению авторов данного исследования, микрофлюидальная пульсирующая система культуры эмбрионов обеспечивает периодическое обновление среды, умеренное удержание биомолекул и

Еще одна культура эмбрионов in-vitro, известная как «культура эмбрионов посредством раскачивания» (tilting embryo culture system, или TECS), представляет собой попытку сообщить развивающемуся эмбриону мыши механический стимул, аналогичный сообщаемому в фаллопиевой трубе (Matsuura et al., 2010). Обычная чашка для культивирования помещается на раскачивающуюся платформу, в результате чего эмбрионы в культуре смещаются под действием гравитации. В рамках этого исследования скорость раскачивания была адаптирована в соответствии со скоростью передвижения (~1 мм/мин) и сдвиговым напряжением (≤1,2 дин/см²) эмбриона мыши в маточной трубе. TECS продемонстрировала значительное улучшение показателей развития бластоцист мышиного зародыша (TECS 59% по сравнению с контрольным показателем на уровне 46%; P < 0,05). Число клеток бластоцист, культивированных по системе TECS, составило was 77 ± 4, при контрольном показателе на уровне  66 ± 4 (P < 0,05). Для размороженных эмбрионов человека показатели развития на стадии бластоцисты, зафиксированные в системе TECS и в контрольных группах, составили 53% и 45%, соответственно. Среднее число клеток развитой бластоцисты на 5-й день культуры in-vitro по принципу TECS составило 43 ± 3, в сравнении с контрольным показателем в размере 34 ± 3 (P < 0,05). Кроме того, TECS продемонстрировала значительное улучшение показателей развития низкокачественных эмбрионов человека и развития эмбрионов мыши, культивированных в оптимальных условиях. По мнению авторов, возможной причиной таких улучшений при развитии обоих типов эмбрионов могли стать механические стимулы, произведенные в результате движения эмбриона (Matsuura et al., 2010), что указывает на возможные преимущества клинического использования TECS.

Вышеизложенные выводы подтверждают результаты предшествующих исследований, в рамках которых фрагменты овариальной ткани были культивированы in vitro с использованием динамической системы (Isachenko et al., 2006, 2007, 2008a,b,c, 2009a,b,c,d, 2010a,b). Культивирование фрагментов овариальной ткани проводилось в течение 2-6 недель в большом объеме среды: сосуд, помещенный в ротационный шейкер, подвергался воздействию с частотой 75 колебаний в минуту. В сравнении со статической системой, фолликулы внутри данных фрагментов ткани показали высокую жизнеспособность и показатели роста. Целью исследования была разработка системы, которая совместила бы в себе преимущества микроканальной пульсации и культуры раскачивания.

Культивирование in-vitro с пульсирующей механической микровибрацией

Изначально, информация о благоприятном воздействии пульсирующей механической микровибрации на цитоплазматическое созревание in-vitro зрелых ооцитов свиней была опубликована группой профессора Мийоши (Mizobe et al., 2010). Авторы публикации подвергли комплексы ооцит-кумулус, культивированные в микрокаплях, воздействию пульсирующей механической вибрации (ПМВ) на частоте 20 Hz с акселерацией (660 mV/г при 3.3 V: X = ±1,0г, Y = ±0,7г, Z = ±0,15г; инструкция производителя). На протяжении созревания in-vitro ПМВ не влияла на число ооцитов, достигающих метафазы-II. Однако показатели формирования бластоцист после активации ооцитов, подвергнутых воздействию ПМВ, были значительно выше (P < 0,05) показателей, полученных для ооцитов, на которые не воздействовала механическая вибрация (27% в сравнении 12% и 26% в сравнении 15%, соответственно, с 5- и 10-секундной пульсацией).

Возникает следующий вопрос: почему авторами была выбрана частота в 20 Hz? Ответ на этот вопрос основывается на:

1. значительном повышении частоты биения ресничек в перешейке и ампуле человека после овуляции, т.е. в рамках секреторной фазы эстрального цикла (Critoph and Dennis, 1977; Lyons et al., 2002);

2. варьировании базовой частоты биения ресничек у различных особей в пределах 5-20 Hz (Paltieli et al., 1995; Weström et al., 1977).

Культура человеческих эмбрионов in-vitro с механической микровибрацией: собственный опыт

Данная работа проводилась на базе частного медицинского центра (Endokrinologikum Ulm, Praxisklinik Frauenstraße, Ulm, Germany, www.kinderwunsch-ulm.de). Парам был предложен выбор между культурой ооцитов и эмбрионов in-vitro в соответствии со стандартными процедурами или с использованием механического воздействия (микровибраций) вплоть до пересадки. От всех участвующих пар было получено письменное согласие с условиями исследования. Пациенты с бесплодием неясного генеза прошли стимуляцию для ЭКО/внутрицитоплазматической инъекции спермы (ИКСИ/ICSI) с использованием трипторелина (Decapeptyl; Ferring, Киль, Германия) и рекомбинанта ФСГ (FSH) (Puregon; Organon, Осс, Нидерланды), с назначением длинного протокола. Овуляция была индуцирована введением 10,000 IU человеческого хорионического гонадотропина (ЧХГ/HCG) (Pregnil; Organon), после чего, спустя 34-36 ч, были получены ооциты, которые затем были оплодотворены сперматозоидами партнера посредством традиционных методов ЭКО и ИКСИ.

Было получено разрешение Комиссии по вопросам этики при Медицинском факультете Ульмского университета (Германия) на культуру эмбрионов in-vitro под воздействием механической стимуляции.

От 148 осведомленных пациентов в возрасте 25–47 лет (средний возраст – 31,6 лет) были получены ооциты для культуры эмбрионов на стадии пронуклеуса. Эти эмбрионы (по два от каждого пациента) были культивированы in vitro в условиях двух типов: группа 1 (74 пациента, n = 148), без механического воздействия на культуру (стандартные условия); и группа 2 (74 пациента, n = 148), с механическим воздействием (44 Hz каждые 5 секунд, с акселерацией (660 mV/г при 3,3 V: X = ±1,0г, Y = ±0,7г, Z = ±0,15г)). Пациенты поочередно были отнесены к двум данным группам. Культура включала только два эмбриона от каждого пациента, так как законами Германии допускается культивирование не более чем трех ооцитов/эмбрионов одного пациента (обычно – два) in vitro, при этом все культивированные ооциты/эмбрионы должны быть впоследствии пересажены пациенту, независимо от показателей их развития; криоконсервация эмбрионов запрещена. Механическое воздействие достигалось с помощью специального нового изобретения. Показатели роста фиксировались 18 часов спустя. Культивация проводилась в 50 µl среды (Sage, Лос-Анджелес, Калифорния, США) с использованием минерального масла (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 3–5 дней до момента пересадки. Следует отметить, что упомянутая выше вибрация на частоте 44 Hz и акселерация являются параметрами движения платформы, на которой расположены чашки Петри с питательной средой и эмбрионами. По результатам лабораторных тестов с ооцитами крупного рогатого скота показатели амплитуды вибрации эмбрионов и клеточной акселерации были ниже, чем показатели вибрации платформы (данные не предоставлены). Этот факт обусловлен инертностью ооцитов, взвешенных в жидкости: питательная среда существенно подавляет вибрации, которые зависят от состава и объема данной среды. Параметры «реальной» вибрации можно рассчитать математически, и в настоящее время проводятся соответствующие исследования. Будущие изыскания в данной области должны привести к оптимизации данных параметров.

Режим механической стимуляции характеризуется двумя основными показателями, длительностью (5 сек/ч) и частотой (44 Hz). Первый показатель (5 секунд с интервалом 1 час) был выбран с учетом результатов, полученных Mizobe et al. (2010). Данные специалисты изучили влияние механической вибрации на созревание и рост ооцитов свиньи в условиях in-vitro и/или in-vitro культуры после искусственной активации. Было установлено, что показатели формирования бластоцист после активации ооцитов, которые созревали под воздействием механической вибрации длительностью 5 секунд с интервалами в 30-60 минут или 10 секунд с интервалами в 60 минут, были выше, чем аналогичные показатели для ооцитов, созревание которых проходило без механического вмешательства (27% в сравнении с 12% и 26% в сравнении с 15%, соответственно). Кроме того, было отмечено улучшение показателей формирования бластоцист от эмбрионов[8] в результате переноса ядра соматической клетки при сообщении ооцитам 5-секундной механической вибрации с 60-минутными интервалами, независимо от наличия или отсутствия аналогичного вмешательства во время культуры in-vitro (17% в сравнении с 9%). На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что механическая вибрация ускоряет цитоплазматическое созревание ооцитов свиньи, полученных in-vitro (Mizobe et al. (2010)).

Второй показатель использованного режима (частота на уровне 44 Hz) можно объяснить явлением Шумана (1952), согласно которому существует т.н. глобальный электромагнитный резонанс в пределах 3-69 Hz. Было выдвинуто предположение о том, что для жизни на Земле вибрация на такой частоте является «физиологической». В целях настоящего исследования частота на уровне 44 Hz была выбрана, исходя из технических условий: данная величина соответствует минимальной частоте вибрации аппарата.

Оценка роста эмбрионов проводилась ежедневно, рано утром. При анализе эмбрионов на 2-й и 3-й день была использована система качественной оценки, предложенная Штеером и др. (Steer et al.) (1992). Пересадка эмбрионов (по два каждому пациента) поводилась на 3-й или на 5-й день после оплодотворения. Согласно законодательству Германии, эмбрионы были пересажены, независимо от этапа развития, включая дегенеративные и остановившиеся в развитии образцы. Беременность устанавливалась на основании повышения концентрации ХГЧ в сыворотке (≥12 IU/ml) через 13-15 дней после пересадки эмбриона. Клиническая беременность фиксировалась при визуализации плодного мешка в ходе ультразвукового исследования на 7-8 гестационной неделе.

Результаты были выражены в форме средних значений ± стандартное отклонение (SD) и в виде процентов. Было проведено сопоставление средних значений для исследуемых групп путем анализа отклонений. Уровень значимости был установлен на отметке P < 0,05.

Среднее число ооцитов на одного пациента составило 7,0 ± 3,7. Показатели формирования пронуклеусов были схожи для статической (73 ± 3,4%) и динамической (76 ± 2,1%) культур in-vitro. В условиях динамичной культуры был зафиксирован существенно более высокий процент эмбрионов отличного (класс А) и хорошего (класс B) качества на этапе 4-6 бластомеров, в сравнении со статической системой (90,1 ± 1,7% против 77,9 ± 4,4%, P < 0,05). Кроме того, в динамичной культуре процент эмбрионов на различных стадиях бластоцист на 10% превышал аналогичный статический показатель (14,1 ± 2,8 против 4,5 ± 1,7, P < 0,05).

Был сделан вывод о том, что in-vitro культивирование  в условиях динамической системы обеспечивает гораздо более высокий показатель беременности, независимо от дня пересадки эмбриона. В сравнении со статической системой, было отмечено увеличение частоты наступления беременности после пересадки 3-дневного эмбриона на 28% (78,4 ± 3,2% против 50,1 ± 4,9%, P < 0,05), а после пересадки 5-дневного эмбриона – на 39% (72,2 ± 1,5% против 33,2 ± 2,4%, P < 0,01).

Пульсирующая механическая микровибрация: механизм положительного эффекта

Что нам известно о микровибрации в целом? Вибрация – это естественное явление, которое относится к механическим колебаниям относительно точки равновесия. С момента зарождения жизни все живое на Земле подвергается воздействию естественной пульсирующей частоты. Это явление было описано в 1952 году (Schumann, 1952) как глобальный электромагнитный резонанс, или резонанс Шумана. Резонансы Шумана представляют собой квазистоящие электромагнитные волны, которые существуют в «электромагнитной» полости Земли (между земной поверхностью и ионосферой). Эти резонансы являются основой электромагнитного спектра 3-69 Hz и проявляются как отчетливые пики на крайне низких частотах от 7.83 (наиболее сильно) до 14, 21, 27, 39 и 45 (слабее всего) Hz. В повседневной жизни подобные вибрации иногда могут быть «желательными» (например, для музыкальных инструментов), но чаще всего – наоборот (потеря энергии и нежелательные звуки, или шумы).

Стимулирующий эффект вибраций на живые системы хорошо известен и играет соответствующую роль в механической трансдукции, которая является необходимым условием выживания как клеток, так и высших организмов. По мнению Закса (Sachs) (1988), механорецепторы на уровне клетки обеспечивают обратную связь для реакций избегания в свободно плавающих простейших, а также для гравитационных и тактильных реакций, которые происходят в растениях. Механизмы трансдукции, вероятно, являются неотъемлемым условием регулирования клеточного объема, размножения и метаболической деятельности, и реализуются посредством различных внутриклеточных путей (Rosenberg, 2003). Известные качества механической  трансдукции  могут быть объяснены ионными каналами, пропускная способность которых контролируется мембранным потенциалом.

Недавние исследования in-vivo и in-vitro показали, что некоторые динамические нагрузки, например, механическая вибрация, носят благотворный характер. Так, нагрузка улучшает сухожильные фибробласты эмбрионов цыплят, способствует заживлению переломов у кроликов и крыс, повышает концентрацию инсулиноподобного фактора роста-I (IGF-I) в сухожилиях и периферических нервах крыс, а также ослабляет неврогенные и скелетно-мышечные боли у человека (Bayliss et al., 1986; Hansson and Dahlin, 1988; Inerot et al., 1991; Jancovich, 1972; Lurdeberg, 1984; Ryusuke and Horoshi, 1992; Sekiya, 2000; Yasuo and Joseph, 1989). И хотя механизмы такого действия остаются неясными, возможно, здесь существует отличие в режимах вибрации (Jancovich, 1972; Yasuo and Joseph, 1989; Ryusuke and Horoshi, 1992).

Эксперименты на мышах показали, что кратковременное воздействие общих вибраций низкого уровня (90 Hz, ± 0,2 г) на организм может ограничить образование жира, стимулируя при этом остиобластогенез. Например, было выявлено, что 6-недельное вибрационное воздействие увеличивает общую популяцию стволовых клеток костного мозга на 37%, а число мезенхимных стволовых клеток – на 46% (Luu et al., 2009). По истечении 14 недель было отмечено снижение формирования висцеральной жировой ткани на 28%, наряду с увеличением объема губчатого вещества большой берцовой кости на 11%. Поскольку костные и мышечные клетки происходят из одной и той же популяции клеток-предшественниц, можно предположить, что популяции клеток костного мозга, подвергшиеся механическому воздействию, связывают различные ткани скелетно-мышечной системы. Согласно авторам исследования, анаболическое и антикатаболическое действие общих вибраций на скелет вряд ли потребует активизации мышечной активности. Даже высокочастотные сигналы, вызывающие деформацию костного матрикса, в размере менее 5 микродеформаций, могут способствовать остеогенезу в отсутствие мышечной активности, при этом подобное механическое вмешательство является безопасным и эффективным (Judex and Rubin, 2010; Judex et al., 2007; Usui et al., 1989). В спортивной медицине распространено использование низкоуровневых механических вибраций как инструмента массажа и/или во время тренировочного процесса. Упомянутый положительный эффект общих вибраций зависит от ряда вспомогательных и блокирующих механизмов нервной системы и вызывает глобальную ответную реакцию на нервно-мышечном, метаболическом и гормональном уровне (Issurin, 2005; Roll et al., 1989).

Применение механических вибраций к соматическим клеткам, культивированным in vitro, активирует их пролиферативные и секреторные свойства. Наблюдения включали:

1. усиленную пролиферацию артикулярных хондроцитов бычков (Kaupp and Waldman, 2008);

2. изменяющееся во времени увеличение синтеза ДНК и стимулирование синтеза протеогликанов в долговременной культуре в ответ на периодические вибрации на частоте 300 Hz (Liu et al., 2001);

3. повышение уровня высвобождения интерлейкина-8 в клетках бронхиального эпителия человека (Puig et al., 2005).

Кроме того, было обнаружено, что вибрационная стимуляция, подобная  вибрациям голосовой складки влияет на экспрессию ряда ключевых матричных и связанных генов, повышают секрецию профибриотических цитокинов, в частности, трансформирующего фактора роста b1, способствуют накоплению белков внеклеточного матрикса, фибронектина и коллагена-1, стимулируют экспрессию матрикса по аналогии со слизистой оболочкой голосовой складки при использовании фибробластов, инкапсулированных в гидрогель, и увеличивают конструктивную жесткость, в сравнении с результатами, полученными без использования стимуляции (Kutty and Webb, 2010; Wolchok et al., 2009). Последние авторы считают, что механическая вибрация является важнейшим эпигенетическим фактором, регулирующим внеклеточный матрикс голосовой складки (ECM), и предполагают, что ускоренное восстановление фонационной микросреды может способствовать сокращению рубцевания вокальных соединений, восстановлению исходной матрицы и улучшению качества работы голосовой складки (Kutty and Webb, 2010). Дальнейшие наблюдения включают вибрации на умеренной частоте (300 Hz, ± 1,4 г), стимулирующие биосинтетический отклик хондроцитов in vitro (Liu et al., 2001), при этом вибрации на частоте 25 Hz увеличивают число основных матричных протеинов в костной ткани и регулируют экспрессию вариантов васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), что указывает на потенциал соответствующих комбинированных нагрузок в отношении функционализации изолированных костеподобных структур (Dumas et al., 2009). Известно также, что VEGF является мощным митогеном эндотелиальных клеток (Ferrara et al., 2003) и играет ключевую роль в индуцировании и регуляции ангиогенеза в рамках физиологических процессов, таких как развитие эмбриона и менструальный цикл, и патологических состояний (например, рост опухоли и атеросклероз) (Ferrara, 2005; Gu and Adair, 1997; Pages and Pouyssegur, 2005).

Значительное незамедлительное повышение показателя VEGF связывается с экзогенно индуцированными вибрациями на частоте 30 Hz (Suhr et al., 2007). Эти результаты подтверждают предположение о том, что механические стимулы по-разному влияют на факторы, вызывающие ангиогенез. Межклеточная коммуникация позволяет клеткам координировать свою физиологическую активность и способствует межклеточному взаимодействию. Это, в свою очередь, позволяет клеточной системе единообразно реагировать на локализованную стимуляцию, т.е. обеспечивает важный отклик в контексте клеточного поведении и дифференциации (Caveney, 1985; Loewenstein, 1981; Spray and Bennett, 1985; Fraser et al., 1987). Результаты текущих исследований прямо или косвенно подтверждают вышеприведенные выводы.

Кроме того, результаты современных исследований, в большинстве своем, совпадают с недавними результатами, полученными Хео и др. (Heo et al.) (2010) и Мацуурой и др. (Matsuura et al.) (2010). Так, механическая стимуляция эмбриона в культуре in-vitro посредством 5-секундной пульсации на частоте 44 Hz/час, рассматриваемая в данной статье, позволила значительно повысить показатели роста и качества эмбриона человека, в сравнении со стандартной статической культурой, но не оказала влияния на оплодотворение введенных ооцитов.

Пульсирующая механическая микровибрация стимулирует межклеточные сигналы

Основной общей характеристикой всех трех методов культуры in-vitro, рассмотренных в данной статье (пульсирующая динамическая культура с использованием микроканалов, культура, культура эмбрионов посредством раскачивания и механическая микровибрация), является механическая стимуляция, вероятно индуцирующая межклеточную коммуникацию. Предполагается, что дополнительными факторами, благотворно влияющими на развитие эмбриона, могут стать обновление питательной среды и перфузия (Heo et al., 2010) при помощи раскачивания или механической вибрации (Matsuura et al., 2010; Mizobe et al., 2010), обеспечивающие перемешивание жидкости и сокращение концентрации токсичных метаболитов эмбриона.

Механизм, благодаря которому внеклеточные сигналы трансформируются во внутриклеточные еще не до конца понятен. Но можно предположить, что данные процессы отклика обусловлены работой рецепторов на поверхности клеток, реагирующих на молекулы матрицы (Karin et al., 1995). В частности, мультифакторное влияние механической вибрации может быть объяснено активацией межклеточной коммуникации. Так, было выдвинуто предположение о том, что межклеточная коммуникация позволяет клетками координировать свою физиологическую деятельность и взаимодействовать друг с другом. Это, в свою очередь, позволяет клеточной системе единообразно реагировать на локализованную стимуляцию, т.е. обеспечивает важный отклик в контексте клеточного поведении и дифференциации (Caveney, 1985; Fraser et al., 1987; Loewenstein, 1981; Spray and Bennett, 1985). Исследование, проведенной группой Дирксена (Dirksen’s group) (Sanderson et al., 1990), явно показало, что механическая стимуляция реснитчатых клеток эпителия в культуре индуцирует волну повышения  Ca2+, которая распространяется от стимулированной клетки к соседним. В отсутствие внеклеточного кальция Ca2+ механически стимулированные клетки не продемонстрировали какого-либо повышения или понижения уровня [Ca2+]i, при этом уровень [Ca2+] в соседних клетках повысился. Кроме того, ионтофоретическое введение инозитола-1,4,5-трифосфата (IP3) в обрабатываемые эпителиальные клетки культуры вызвало коммуникативный отклик Ca2+, подобный отклику, вызванному механической стимуляцией. Полученные данные позволили авторам исследования сделать вывод о том, что IP3 действует в качестве клеточного агента, способствующего передаче сигнала посредством щелевого контакта между реснитчатыми клетками эпителия.

Выводы

Культивирование  эмбриона человека in-vitro в среде, которая подвергается механическому воздействию с регулярными короткими интервалами, приводит к повышению показателей роста. Данный тип культуры представляет собой попытку имитации естественных условий, при которых жидкость маточной трубы механически приводится в движение при помощи ресничек эпителия. Полученные таким образом первые результаты нуждаются в независимом подтверждении и дальнейшем анализе переменных.

Благодарности

Авторы статьи выражают признательность Игорю Перелыгину, клиника репродуктивной  «Генезис Днепр», г. Днепропетровск, Украина,  за информативное обсуждение некоторых биофизических вопросов в контексте данной методологии.

©2011, Reproductive Healthcare Ltd. Published by Elsevier Ltd. Все права защищены.